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技术干货 | 揭秘细胞系鉴定的那些事儿

发布时间:2022-06-14 17:25 信息来源: 阅读次数:


上期推文《药典解读 | 如何给细胞做一次全面“体检”?》中提到,细胞“体检”的第一步是进行“细胞鉴定”,也就是鉴别细胞的身份,证明“该细胞是该细胞”,没有被误认,也没有出现交叉污染的情况。


那么……你是不是有许多问号?


为什么要进行细胞系鉴定


细胞是生产抗体、蛋白药物、疫苗的“母体”,也是进行细胞治疗、基因治疗的基础。细胞的质量优劣、特性稳定与否、种属差异程度的影响贯穿生物制品的研发、生产及临床应用的全过程。


如因使用了交叉污染或错误辨识的细胞会导致研究结论错误、结果不可重复、临床细胞治疗失败等,给研究者、药品生产者等带来不可估量的损失,甚而威胁到患者的生命健康。


为此,各种杂志如Nature、Science、Cell等曾多次发出呼吁,要求研究者对细胞进行鉴定。


相关法规要求

《中国药典》2020年版:新建细胞系/株、细胞库( MCB 和 WCB)和生产终末细胞应进行鉴别试验,以确认为本细胞,且无其他细胞的交叉污染。


ICH Q5D 用于生物技术产品及生物制品生产的细胞基质的来源和鉴定:应采用合适的试验证明建库的细胞就是它本身。鉴别试验可利用细胞的表型或遗传型特征,但不必作所有的试验。通常对MCB作鉴别试验,而对每个WCB仅作有限的鉴别试验。




什么时候需进行细胞系鉴定


1

当建立或获得一个新的细胞系时;

2

使用细胞进行临床治疗(试验)前;

3

研究项目或生产过程涉及到细胞试验,在其开始/结束时;

4

在细胞冻存之前,或细胞已连续培养 2~3 个月时;

5

发表文章或申请课题经费前;

6

细胞系表现不稳定或结果与预期差别较大时;

7

当实验室使用超过一种细胞系时,所有细胞系最好先鉴定以排除交叉污染的可能。


细胞系鉴定的方法


细胞培养中可以使用许多方法对交叉污染进行鉴定,药典规定应至少选择下述一种或几种方法对细胞进行种属和细胞株间及专属特性的鉴别。

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1

细胞形态观察

通过观察细胞形态,初步判断细胞生物属性,如细胞生长状态等,以下为常见的几种细胞形态:

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2

STR鉴定

STR(Short Tandem Repeat,短串联重复序列) 基因位点由长度为 3~7 个碱基对的短串联重复序列组成,这些重复序列广泛存在于人类基因组中,可作为高度多态性标记,被称为细胞的 DNA 指纹,其可通过一定的计算方法,即可根据所得的 STR 分型结果与专业的细胞 STR 数据库比对,从而推算出样品所属的细胞系或可能的交叉污染的细胞系名称。

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3

同工酶

同工酶(isoenzyme)是指蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同,但是催化的化学反应相同的一组酶。这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至是不同的细胞中。


同工酶的结构差异在一定条件下能在电泳上区分出来,常用于细胞系种属鉴定,通常以乳酸脱氢酶(LD)、嘌呤核苷磷酸化酶(NP)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、苹果酸脱氢酶(MD)等几种酶谱为常用分析指标。

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4

染色体核型分析

染色体核型分析是以分裂中期的染色体为研究对象,根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征,并借助显带技术对染色体进行分析、比较、排序和编号,根据染色体结构和数目的情况来进行鉴别。核型分析可以为细胞遗传分类、物种间亲缘的关系以及染色体数目和结构变异的研究提供重要依据。


显带技术指通过特殊的染色方法使染色体的不同区域着色,使染色体在光镜下呈现出明暗相间的带纹。常用的三大显带技术包括:G显带、Q显带和R显带。其中,G显带运用最广泛,指标本经胰蛋白酶处理后,应用Giemsa染色,随后镜检、分析;R显带(R-bandin)指中期染色体不经盐酸水解或不经胰酶处理的情况下,经Giemsa染色,所呈现的是与G显带着色相反的情况,故又称反带;Q显带,指荧光显带,同G显带带纹。

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5

DNA指纹图谱

DNA 指纹图谱技术(DNA-Fingerprinting)由英国科学家 Jeffreys 于 1986 年开发,具有完全个体特异的DNA多态性图谱,其个体识别能力足以与手指指纹相媲美,因而得名。DNA 指纹图谱技术具有快速、准确等优点,是鉴别品种、品系的有力工具,已广泛应用于很多作物的品种资源多样性和纯度鉴定研究。


其中SSR(simple sequence repeat)和SNP(single nucleotide polymorphism)分子标记已被国际植物新品种权保护联盟(UPOV)BMT分子测试指南和国内《植物品种鉴定DNA指纹方法总则》(NY/T2594-2016)定为优先推荐的两种标记方法。


相较于传统的分子标记,SNPs在基因组中更丰富,具有数量大、基因组分布广、稳定性和遗传力高、鉴定简单等优点,可用于快速、高通量的基因分型分析。构建基于SNP标记技术的DNA指纹图谱对于品种特异性和真实性鉴别具有重要意义。

6

DNA条形码技术

DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术。由加拿大动物学家Paul Hebert首次提出,其团队对动物界包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13320个物种的细胞色素C氧化酶I基因(cytochrome Coxidase I gene)基因序列比较分析,发现98%的物种遗传距离差异在种内0%-2%,种间平均可达到11.3%,据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种。


由于细胞色素C氧化酶I基因(cytochrome Coxidase I gene)和细胞色素B线粒体基因序列在种属内高度保守,而在种属间差异较大,针对不同种属设计特异性引物,每一个种属都能扩增出一个特定大小的片段。可采用琼脂糖凝胶电泳方法检测扩增产物,并进一步测序,以此作为细胞种属鉴别和交叉污染检测的的依据。


DNA条形码技术具有检测样本范围大、准确性高、可快速鉴定大量样本等优点,是传统形态鉴别方法的有效补充。

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